在食品中餐飲業中，直接與食物接觸的工作台、砧板、容器等，需要適當的清潔與消毒，以減少微生物的污染，降低食品中毒或腐敗的風險。本次實驗，將比較中餐 教室的工作檯面與砧板在消毒前與消毒後殘存生菌數之差異，也將在下學期的課程依照GHP的消毒條件，測試餐具與容器消毒前後的菌數差異及消毒效果。
本次實驗使用 70% 的乙醇進行消毒。
實驗步驟:
1. 使用試管架，帶著四隻試管 (內有 10 ML滅過菌的 0.85% Nacl)，消毒酒精、餐巾紙、矽膠框、奇異筆，到中餐教室取樣。
2. 在食物接觸面，尤其是處理即食或熟食的工作檯面，選定相近的兩塊區域，分別對未消毒及自行消毒的進行微生物取樣。
3. 打開無菌棉花棒，取出一隻，插入試管中沾取生理食鹽水，鋪上矽膠框 ，( 10.5 cm x 10.5 cm)，
以不碰到矽膠框的操作下，分別用三個方向來回塗抹，同時轉動棉花棒，使其均勻塗抹(塗抹動作)。
4. 完成後插回試管，並折斷剛才手指碰觸的部分，上緊蓋子，帶回實驗室(採 菌動作)。
5. 使用酒精噴灑特定區域，等30秒後使用紙巾擦去，等自然乾後同上述的步驟取樣。
6. 回到實驗室，進行 1 + 9 的稀釋兩次，並各取 1 ML 滴加在已經標示好的無菌空白培養皿。
7.領取TCA培養基 (在水浴槽保溫)，倒入培養皿，均勻混合，等待冷凝後倒置在35 度中培養 48 小時。
塗抹:打開無菌棉花棒，取出一隻，插入試管中沾取生理食 鹽水，鋪上矽膠框，不碰到矽膠框為原則塗抹之後消毒再重複動作塗抹。
以下 “ 塗抹 ”皆為上述動作
採菌:完成後插回試管，並折斷剛剛手指碰觸的地方，上緊 蓋子，接下來砧板循環此方法。
以下“ 採菌 ”皆為上述動作
實驗參考食品衛生管理法第二十五條食品微生物之檢驗方法－生菌數之檢驗
食品微生物之檢驗方法－生菌數之檢驗 Methods of Test for Food MicroorganismsTest of Standard Plate Count (Aerobic Plate Count) 1. 適用範圍：本方法適用於食品中生菌數之檢驗。 2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以平板計數培養基培養及計數之方法。 2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為 100 呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流 動空氣。每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU/培養皿。 2.2. 器具及材料 2.2.1. 乾熱滅菌器。 2.2.2. 高壓滅菌釜。 2.2.3. 冰箱：能維持 5 ± 3℃者。 2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0℃以內者。 2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差± 1.0℃以內者。 2.2.6. 攪拌均質器(Blender)或鐵胃(Stomacher)：能適用於無菌操作者。 2.2.7. 天平：可稱量到 2000 g，靈敏度為 0.1 g；可稱量到 120 g，靈 敏度為 5 mg。 2.2.8. 旋渦混合器(Vortex mixer)。 2.2.9. 酸鹼度測定儀(pH meter)。 2.2.10. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。 2.2.11. 吸管輔助器(Pipette aid)。 2.2.12. 吸管(Pipette)：已滅菌。1 mL 吸管應有 0.01 mL 之刻度；5 mL 及 10 mL 吸管應有 0.1 mL 刻度。 2.2.13. 培養皿：已滅菌，內徑約 90 mm，深度約 15 mm，底皿之內外 面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。 2.2.14. 稀釋用容器：無菌袋或有 1000 mL、500 mL、99 mL 及 90 mL 標記附蓋(栓)之可滅菌廣口瓶。 2.2.15. 藥勺、剪刀、小刀、壓舌板及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。 2.2.16. pH 試紙：範圍 6-8。 2.2.17. 試藥：氯化鈉、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氫氧化鈉、葡萄糖(glucose) 及油酸聚醇山梨酯(polysorbate 80, Tween 80)均採用試藥級；蛋 白腖(peptone)、胰化蛋白腖(tryptone)、酵母抽出物(yeast extract) 及洋菜(agar)均採用微生物級。 2.2.18. 1N 氫氧化鈉溶液之配製： 稱取氫氧化鈉 4 g，加入無菌水溶解使成 100 mL。 2.2.19. 稀釋液之配製： 2.2.19.1. 生理食鹽水： 101 年 11 月 19 日署授食字第 1011902832 號公告 2 取氯化鈉 8.5 g，溶於蒸餾水 1000 mL 中，分裝於稀釋用容 器中，經 121℃滅菌 15 分鐘。 2.2.19.2. 磷酸鹽緩衝液 (Butterfield's phosphate-buffered dilution water)： 取磷酸二氫鉀 34 g，溶於蒸餾水 500 mL，以 1N 氫氧化鈉 溶液調整 pH 值為 7.2，再加蒸餾水使成 1000 mL，以 121℃ 滅菌 15 分鐘，貯存於冰箱中，作為原液。使用時，取原液 1.25 mL，加入蒸餾水使成 1000 mL，分裝於稀釋用容器中， 以 121℃滅菌 15 分鐘。 2.2.19.3. 0.1%蛋白腖稀釋液(0.1% peptone diluent)： 取蛋白腖 1 g，溶於蒸餾水使成 1000 mL，分裝於稀釋用容 器中，經 121℃滅菌 15 分鐘，最終 pH 值為 7.0 ± 0.1。 2.2.20. 平板計數培養基(Plate count agar, PCA)，亦稱標準方法培養基 (Standard method agar) 胰化蛋白腖(tryptone) ................................................................ 5 g 酵母抽出物(yeast extract)........................................................ 2.5 g 葡萄糖 (glucose)............................................................................1 g 洋菜 (agar).................................................................................. 15 g 蒸餾水…………………………………………………….1000 mL 加熱溶解後，分裝於適當之容器中，經 121℃滅菌 15 分鐘，最 後 pH 值為 7.0 ± 0.2。 2.3. 檢液之調製 2.3.1. 固態檢體：將檢體切碎混合均勻後，取 50 g，加入稀釋液 450 mL，混合均勻，作為 10 倍稀釋檢液。 2.3.2. 粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體：以已滅菌之藥勺或其他用 具將檢體粉碎後，混合均勻，取 50 g，以下步驟同 2.3.1.節之操 作。 2.3.3. 液態檢體：將檢體振搖均勻混合，取 50 mL，作為原液，以下 步驟同 2.3.1.節之操作。 2.3.4. 冷凍檢體：須解凍者，如冷凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等，應 在冷藏之溫度下解凍(如 2～5℃，18 小時內即可解凍完全)；亦 可使用較高溫度快速解凍(置於 45℃以下之水浴中，可在 15 分 鐘內解凍之檢體適用之)。解凍時應經常搖動檢體，以加速解 凍。俟檢體解凍後，再予以切碎並混合均勻。不須解凍者，如 食用冰塊、冰棒等冰類製品，應速先行使成適當小塊；再依 2.3.1. 節，製成 10 倍稀釋檢液。如檢驗工作無法立即進行，應將檢體 貯存於-20℃。 2.3.5. 凝態及濃稠液態檢體：如布丁、煉乳、海苔醬等，經攪拌均勻 101 年 11 月 19 日署授食字第 1011902832 號公告 3 50 g 或 50 mL (原液) 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 90 mL 450 mL 90 mL 90 mL 10 倍 100 倍 1000 倍 10000 倍 後，取 50 g，以下步驟同 2.3.1.節之操作。 2.3.6. 系列稀釋檢液：使用已滅菌之吸管，吸取上述之 10 倍稀釋檢液 10 mL 加至稀釋液 90 mL 中，依序作成 100 倍、1000 倍、10000 倍等一系列稀釋檢液，其稀釋方法如下圖所示。 註： 1. 除肉製品使用 0.1%蛋白腖稀釋液外，其他檢體以磷酸鹽緩衝液 作為稀釋液，其次為生理食鹽水。 2. 檢體總量不足 50 g (mL)時，應依檢體量，添加適量之稀釋液， 作成 10 倍稀釋檢液。 3. 處理含油脂量多，不易勻散及易起泡沫之檢體時，應加入適量 已滅菌之乳化劑(如 Tween 80，使其於檢液中濃度為 1%)，並充 分振搖，使之乳化。 2.4. 生菌之培養 2.4.1. 將稀釋檢液及(或)原液充分振搖，混合均勻。 2.4.2. 各吸取各稀釋檢液及(或)原液 1 mL 分別置入培養皿中，各檢液 至少做二重複。 2.4.3. 另吸取稀釋液 1 mL 置入培養皿中，作為空白對照組(二重複)。 2.4.4. 2.4.2.節及 2.4.3.節之各培養皿中倒入冷卻至 45 ± 1℃之平板計 數培養基(PCA) 12～15 mL，搖動混合，自檢液之調製至此步驟 應於 15 分鐘內完成。 2.4.5. 將 2.4.4.節之培養基平板靜置，待培養基凝固後，倒置於 35℃培 養 48 ± 2 小時。 2.5. 生菌之計算 2.5.1. 經培養後，選取 25～250 個菌落之兩個平板來計數，其生菌數 之表示方式為 CFU/g 或 CFU/mL。 2.5.2. 若各稀釋倍數中僅有一種稀釋倍數平板之菌落數為 25～250 個，則應以該稀釋倍數之兩個平板之菌落數平均值乘其稀釋倍 數，即得其生菌數(附表：樣品編號 1)；但若有兩種稀釋倍數之 101 年 11 月 19 日署授食字第 1011902832 號公告 4 平板之菌落數在 25～250 個之間時，則應依下列公式計算之， 但生菌數結果表示時應將該數字第三位數字四捨六入(當第三 位數字為五時，遇第二位數字為奇數時進位，偶數時捨去)，使 其有效數為兩位。(附表：樣品編號 2)。 生菌數(CFU/g 或 CFU/mL)＝ 2 1 B 2 Ba Bb A 2 Aa Ab
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